2 × Pfu PCR ድብልቅ

ሀ -1 አብነት

Template አብነቱ የፕሮቲን ቆሻሻዎችን ወይም የታክ ማገጃዎችን ፣ ወዘተ ይ containsል ——— የዲ ኤን ኤ አብነት ያፅዱ ፣ የፕሮቲን ብክለቶችን ያስወግዱ ወይም አብነት ዲ ኤን ኤን በማጣራት ኪት ያወጡ።

Of የአብነት ማካካሻ አልተጠናቀቀም ———የዲፕሬቲቭ የሙቀት መጠንን ይጨምሩ እና የደንብ ጊዜን ያራዝሙ።

■ የአብነት መበላሸት —— አብነቱን እንደገና ያዘጋጁ።

ሀ -2 ፕሪመር

Of ዝቅተኛ ጥራት ያላቸው ጠቋሚዎች —— ፕሪመርን እንደገና ማቀነባበር።

■ ፕሪሚየር ማሽቆልቆል —— ከፍተኛ ጥበቃን ለማከማቸት በትንሽ መጠን ውስጥ ይቅረጹ። ብዙ ማቀዝቀዝ እና ማቅለጥን ወይም የረጅም ጊዜ 4 ዲግሪ ሴንቲግሬድ ጠብቆ ማቆየትን ያስወግዱ።

Prime ተገቢ ያልሆነ የቅድመ -ንድፍ (ለምሳሌ የመጀመርያ ርዝመት በቂ አይደለም ፣ በዲሚየር መካከል የተፈጠረ ዲሜር ፣ ወዘተ) -ፕሪሚየር አርማዎችን (ፕሪመር ዲሜር እና ሁለተኛ መዋቅር ከመፍጠር ይቆጠቡ)

ኤ -3 ሚ²⁺ትኩረት

■ ኤም²⁺ ትኩረቱ በጣም ዝቅተኛ ነው ——በመጠን Mg ይጨምሩ²⁺ ማጎሪያ -ኤምጂውን ያሻሽሉ²⁺ ጥሩውን Mg ለመወሰን ከ 1 ሚሜ እስከ 3 ሚሜ በተከታታይ ምላሾች ማጎሪያ በ 0.5 ሚሜ መካከል²⁺ ለእያንዳንዱ አብነት እና ፕሪመር ትኩረት።

ሀ -4 የማቅለጫ ሙቀት

High ከፍ ያለ የማብሰያው ሙቀት በፕሪመር እና በአብነት ትስስር ላይ ተጽዕኖ ያሳድራል። —— የማቅለጫውን የሙቀት መጠን ይቀንሱ እና ሁኔታውን በ 2 ዲግሪ ሴንቲግሬድ ደረጃ ያሻሽሉ።

ሀ -5 የኤክስቴንሽን ጊዜ

■ አጭር የማራዘሚያ ጊዜ —— የቅጥያ ጊዜን ይጨምሩ።

ፍኖሜና - አሉታዊ ናሙናዎች እንዲሁ የዒላማውን ተከታታይ ባንዶች ያሳያሉ።

ሀ -1 የ PCR መበከል

Target የዒላማ ቅደም ተከተል ወይም የማጉላት ምርቶች ተሻጋሪ መበከል —— —እንዲሁም የዒላማውን ቅደም ተከተል የያዘውን ናሙና በአሉታዊው ናሙና ውስጥ ላለማፍሰስ ወይም ከማዕከላዊው ቱቦ ውስጥ እንዳያፈሱ። የ reagents ወይም መሣሪያዎች ነባር ኑክሊክ አሲዶችን ለማስወገድ አውቶሞቢል መሆን አለባቸው ፣ እና የብክለት መኖር በአሉታዊ ቁጥጥር ሙከራዎች መወሰን አለበት።

■ የ reagent ብክለት —— reagents ን ያጥፉ እና በዝቅተኛ የሙቀት መጠን ያከማቹ።

ሀ -2 ፕራይምr

■ ኤም²⁺ ትኩረቱ በጣም ዝቅተኛ ነው ——በመጠን Mg ይጨምሩ²⁺ ማጎሪያ -ኤምጂውን ያሻሽሉ²⁺ ጥሩውን Mg ለመወሰን ከ 1 ሚሜ እስከ 3 ሚሜ በተከታታይ ምላሾች ማጎሪያ በ 0.5 ሚሜ መካከል²⁺ ለእያንዳንዱ አብነት እና ፕሪመር ትኩረት።

Per ተገቢ ያልሆነ የመጀመሪያ ደረጃ ንድፍ ፣ እና የዒላማው ቅደም ተከተል ኢላማ ካልሆነ ቅደም ተከተል ጋር ተመሳሳይነት አለው። —— እንደገና ንድፍ አውጪዎች።

Phenomena: የ PCR ማጉያ ባንዶች ከሚጠበቀው መጠን ጋር ይጣጣማሉ ፣ ትልቅም ይሁን ትንሽ ፣ ወይም አንዳንድ ጊዜ ሁለቱም የተወሰኑ የማጉያ ባንዶች እና ልዩ ያልሆኑ የማጉያ ባንዶች ይከሰታሉ።

ሀ -1 ቀዳሚ

■ ደካማ የመጀመሪያ ደረጃ ልዩነት

—— የሪ-ንድፍ ፕሪመር።

Prim የመጀመሪያ ደረጃ ትኩረቱ በጣም ከፍተኛ ነው ——የዲፕሬቲቭ የሙቀት መጠንን በትክክል ይጨምሩ እና የዴንቴሽን ጊዜን ያራዝሙ።

ሀ -2 ሚ²⁺ ትኩረት

M ኤም²⁺ ማጎሪያ በጣም ከፍተኛ ነው ——— የ Mg2+ ትኩረትን በደንብ ይቀንሱ -ኤምጂውን ያሻሽሉ²⁺ ጥሩውን Mg ለመወሰን ከ 1 ሚሜ እስከ 3 ሚሜ በተከታታይ ምላሾች ማጎሪያ በ 0.5 ሚሜ መካከል²⁺ ለእያንዳንዱ አብነት እና ፕሪመር ትኩረት።

A-3 Thermostable polymerase

En ከመጠን በላይ የኢንዛይም መጠን —— በ 0.5 ዩ መካከል የኢንዛይም መጠንን በተገቢው ሁኔታ ይቀንሱ።

ሀ -4 የማቅለጫ ሙቀት

An የማቅለጫው የሙቀት መጠን በጣም ዝቅተኛ ነው ——የመቀየሪያውን የሙቀት መጠን በትክክል ይጨምሩ ወይም ባለ ሁለት-ደረጃ የማቅለጫ ዘዴን ይቀበሉ

A-5 PCR ዑደቶች

PC በጣም ብዙ የ PCR ዑደቶች —— የ PCR ዑደቶችን ቁጥር ይቀንሱ።

ሀ -1 ቀዳሚ——የደሃነት ልዩነት —— ፕሪሚየርን እንደገና ዲዛይን ያድርጉ ፣ ልዩነቱን ለማሳደግ የመቀየሪያውን አቀማመጥ እና ርዝመት ይለውጡ ፣ ወይም ጎጆ ያለው PCR ያከናውኑ።

ኤ -2 አብነት ዲ ኤን ኤ

—— አብነቱ ንፁህ አይደለም —— አብነቱን ያፅዱ ወይም ዲ ኤን ኤን በማጣራት ኪት ያወጡ።

ኤ -3 ሚ²⁺ ትኩረት

—— mg²⁺ ትኩረቱ በጣም ከፍ ያለ ነው ——ግ Mg ን በደንብ ይቀንሱ²⁺ ማጎሪያ -ኤምጂውን ያሻሽሉ²⁺ ጥሩውን Mg ለመወሰን ከ 1 ሚሜ እስከ 3 ሚሜ በተከታታይ ምላሾች ማጎሪያ በ 0.5 ሚሜ መካከል²⁺ ለእያንዳንዱ አብነት እና ፕሪመር ትኩረት።

A-4 dNTP

—— የዲኤንቲፒዎች ትኩረት በጣም ከፍተኛ ነው—— የዲኤንቲፒ ትኩረትን በአግባቡ ይቀንሱ

ሀ -5 የማቅለጫ ሙቀት

—— በጣም ዝቅተኛ የአናኒንግ ሙቀት ——የመጠለያውን የሙቀት መጠን በትክክል ይጨምሩ

ሀ -6 ዑደቶች

—— ብዙ ዑደቶች —— የዑደት ቁጥሩን ያሻሽሉ

የመጀመሪያው እርምጃ ተገቢውን ፖሊመርዜሽን መምረጥ ነው። በ 3'-5 'exonuclease እንቅስቃሴ እጥረት ምክንያት መደበኛ Taq ፖሊሜሬዝ እንደገና ማንበብ አይችልም ፣ እና አለመመጣጠን ቁርጥራጮች የቅጥያ ቅልጥፍናን በእጅጉ ይቀንሳል። ስለዚህ ፣ መደበኛ ታክ ፖሊሜሬዝ ከ 5 ኪ.ባ የሚበልጡ የዒላማ ቁርጥራጮችን በብቃት ማጉላት አይችልም። Taq polymerase በልዩ ማሻሻያ ወይም በሌላ ከፍተኛ ታማኝነት ፖሊሜሬዝ የቅጥያ ቅልጥፍናን ለማሻሻል እና የረጅም ቁርጥራጭ ማጉያ ፍላጎቶችን ለማሟላት መመረጥ አለበት። በተጨማሪም ፣ ረጅም ቁርጥራጮች ማጉላት እንዲሁ የቅድመ-ንድፍ ዲዛይን ፣ የዲታቴሽን ጊዜ ፣ ​​የኤክስቴንሽን ጊዜ ፣ ​​ቋት ፒኤች ፣ ወዘተ ተጓዳኝ ማስተካከያ ይጠይቃል። የአብነት ጉዳትን ለመከላከል ፣ በ 94 ዲግሪ ሴንቲግሬድ ላይ ያለው የዴታቴሽን ጊዜ በአንድ ዑደት ወደ 30 ሰከንድ ወይም ከዚያ በታች መቀነስ አለበት ፣ እና ከማጉላቱ በፊት ወደ 94 ° ሴ የሙቀት መጠን ከፍ ለማድረግ ጊዜው ከ 1 ደቂቃ ያነሰ መሆን አለበት። በተጨማሪም ፣ የቅጥያውን የሙቀት መጠን በ 68 ዲግሪ ሴንቲግሬድ ገደማ ማዘጋጀት እና በ 1 ኪቢ/ደቂቃ መጠን መሠረት የኤክስቴንሽን ጊዜን ዲዛይን ማድረጉ የረጅም ቁርጥራጮችን ውጤታማ ማጉላት ያረጋግጣል።

በከፍተኛ ታማኝነት የተለያዩ የዲ ኤን ኤ ፖሊሜረሎችን በመጠቀም የ PCR ማጉላት የስህተት መጠን ሊቀንስ ይችላል። እስካሁን ከተገኙት ሁሉም የታክ ዲ ኤን ኤ ፖሊሜረሎች መካከል ፣ የፉፉ ኢንዛይም ዝቅተኛው የስህተት መጠን እና ከፍተኛ ታማኝነት አለው (የተያያዘውን ሰንጠረዥ ይመልከቱ)። ከኤንዛይም ምርጫ በተጨማሪ ፣ ተመራማሪዎች የመጠባበቂያ ቅንጅትን ማሻሻል ፣ የሙቀት መቆጣጠሪያ ፖሊመሬስን ትኩረት እና የ PCR ዑደት ቁጥርን ማሻሻል ጨምሮ የምላሽ ሁኔታዎችን በማሻሻል የ PCR ሚውቴሽን መጠንን የበለጠ ሊቀንሱ ይችላሉ።