TIANSeq ፈጣን አር ኤን ኤ ቤተ -መጽሐፍት ኪት (illumina)

በአሁኑ ጊዜ ከፍተኛ ውጤት ማስገኛ ቴክኖሎጂ በዋናነት በሚቀጥለው ትውልድ ቅደም ተከተል ቴክኖሎጂ ላይ የተመሠረተ ነው። የሚቀጥለው ትውልድ ቅደም ተከተል ቴክኖሎጂ የንባብ ርዝመት ውስን በመሆኑ የሙሉውን ርዝመት ቅደም ተከተል ወደ ትናንሽ ቁርጥራጭ ቤተ -ፍርግሞች ወደ ቅደም ተከተል መከፋፈል አለብን። በተለያዩ የቅደም ተከተል ሙከራዎች ፍላጎቶች መሠረት እኛ ብዙውን ጊዜ ነጠላ-መጨረሻ ቅደም ተከተል ወይም ባለ ሁለት-ደረጃ ቅደም ተከተል እንመርጣለን። በአሁኑ ጊዜ የሚቀጥለው ትውልድ ቅደም ተከተል ቤተ-መጽሐፍት የዲ ኤን ኤ ቁርጥራጮች በአጠቃላይ ከ200-800 bp ባለው ክልል ውስጥ ተሰራጭተዋል።

ሀ) ዲ ኤን ኤ በጥራት ደካማ እና አጋቾችን ይይዛል። የኢንዛይም እንቅስቃሴን እንዳይታገድ ከፍተኛ ጥራት ያላቸውን የዲ ኤን ኤ ናሙናዎችን ይጠቀሙ።

ለ) የዲ ኤን ኤ ቤተ-መጽሐፍት ለመገንባት ከ PCR ነፃ ዘዴ ሲጠቀሙ የዲ ኤን ኤ ናሙናው መጠን በቂ አይደለም። የተቆራረጠው ዲ ኤን ኤ ግብዓት ከ 50 ng ሲበልጥ ፣ በቤተ መፃህፍቱ ግንባታ ሂደት ውስጥ ከ PCR ነፃ የሥራ ፍሰት በመምረጥ ሊከናወን ይችላል። የቤተ መፃህፍቱ የቅጂ ቁጥር በጣም ዝቅተኛ ከሆነ ቀጥታ ቅደም ተከተል እንዲኖረው ከተደረገ ፣ ከአስማሚው ማያያዣ በኋላ የዲ ኤን ኤ ቤተ -መጽሐፍት በ PCR ሊጨምር ይችላል።

ሐ) አር ኤን ኤ መበከል ወደ ትክክለኛ ያልሆነ የመጀመሪያ ዲ ኤን ኤ መመዘኛ ይመራል አርኤንኤ መበከል በጄኖሚክ ዲ ኤን ኤ የመንጻት ሂደት ውስጥ ሊኖር ይችላል ፣ ይህም በቤተ መጻሕፍት ግንባታ ወቅት ትክክለኛ ያልሆነ የዲ ኤን ኤ መጠንን እና በቂ የዲ ኤን ኤ ጭነት እንዲኖር ሊያደርግ ይችላል። አር ኤን ኤ በ RNase በማከም ሊወገድ ይችላል።

ሀ -1

ሀ) ትናንሽ ቁርጥራጮች (60 bp-120 bp) ይታያል ትናንሽ ቁርጥራጮች ብዙውን ጊዜ አስማሚዎች ቁርጥራጮች ወይም አስማሚዎች የተሠሩ ዲሜሮች ናቸው። በ Agencourt AMPure XP መግነጢሳዊ ዶቃዎች መንጻት እነዚህን አስማሚ ቁርጥራጮች በብቃት ማስወገድ እና የቅደም ተከተል ጥራትን ማረጋገጥ ይችላል።

ለ) ከ PCR ማጉላት በኋላ ትላልቅ ቁርጥራጮች በቤተ መፃህፍት ውስጥ ይታያሉ አስማሚው ከተገጠመ በኋላ የቤተ መፃህፍቱ የዲ ኤን ኤ ቁርጥራጭ መጠን በ 120 ቢፒ ይጨምራል። ከአስማሚው ማያያዣ በኋላ የዲ ኤን ኤው ቁርጥራጭ ከ 120 ቢፒ በላይ ከጨመረ ፣ ከመጠን በላይ የ PCR ማጉላት ባልተለመደ ቁራጭ ማጉላት ምክንያት ሊሆን ይችላል። የ PCR ዑደቶችን ቁጥር መቀነስ ሁኔታውን መከላከል ይችላል።

ሐ) ያልተለመደ የመጽሐፍት ዲ ኤን ኤ ቁርጥራጮች ከአስማሚ ማጣበቂያ በኋላ በዚህ ኪት ውስጥ ያለው አስማሚው ርዝመት 60 ቢፒ ነው። የቁራጩ ሁለቱ ጫፎች ወደ አስማሚዎች ሲገጣጠሙ ፣ ርዝመቱ በ 120 ቢፒ ብቻ ይጨምራል። በዚህ ኪት ከሚሰጠው ሌላ አስማሚ ሲጠቀሙ እባክዎን እንደ አስማሚ ርዝመት ያሉ ተዛማጅ መረጃዎችን ለማቅረብ አቅራቢውን ያነጋግሩ። እባክዎን የሙከራ የሥራ ፍሰት እና አሠራሩ በመመሪያው ውስጥ የተገለጹትን ደረጃዎች እንዲከተሉ ያረጋግጡ።

መ) አስማሚው ከመገጣጠሙ በፊት ያልተለመደ የዲ ኤን ኤ ቁርጥራጭ መጠን የዚህ ችግር ምክንያት በዲ ኤን ኤ ክፍፍል ወቅት በተሳሳተ የምላሽ ሁኔታ ምክንያት ሊሆን ይችላል። ለተለያዩ የዲ ኤን ኤ ግብዓቶች የተለያዩ የምላሽ ጊዜያት ጥቅም ላይ መዋል አለባቸው። የዲ ኤን ኤ ግብዓቱ ከ 10 ng በላይ ከሆነ ፣ ለማመቻቸት እንደ መነሻ ጊዜ የ 12 ደቂቃ የምላሽ ጊዜን እንዲመርጡ እንመክራለን ፣ እና በዚህ ጊዜ የሚመረተው ቁራጭ መጠን በዋነኝነት በ 300-500 bp ክልል ውስጥ ነው። በሚፈለገው መጠን የዲ ኤን ኤ ቁርጥራጮችን ለማመቻቸት ተጠቃሚዎች እንደየራሳቸው መስፈርቶች ለዲኤንኤ ቁርጥራጮች ርዝመት ለ 2-4 ደቂቃዎች ሊጨምሩ ወይም ሊቀንሱ ይችላሉ።

ሀ -2

ሀ) የተቆራረጠበት ጊዜ አልተመቻቸም የተቆራረጠው ዲ ኤን ኤ በጣም ትንሽ ወይም በጣም ትልቅ ከሆነ ፣ እባክዎን የምላሽ ጊዜውን ለመወሰን በትእዛዙ ውስጥ የተሰጠውን የመከፋፈል ጊዜ ምርጫ መመሪያዎችን ይመልከቱ ፣ እና ይህንን የጊዜ ነጥብ እንደ መቆጣጠሪያ ይጠቀሙ ፣ በተጨማሪ ያዋቅሩ በተቆራረጠ ጊዜ ላይ የበለጠ ትክክለኛ ማስተካከያ ለማድረግ 3 ደቂቃን ለማራዘም ወይም ለማሳጠር የምላሽ ስርዓት።

ሀ -3

ከተበታተነ ህክምና በኋላ ያልተለመደ የዲ ኤን ኤ ስርጭት

ሀ) ትክክለኛ ያልሆነ የማቅለጫ ዘዴ የመከፋፈያ reagent ፣ ወይም reagent ከቀለጠ በኋላ ሙሉ በሙሉ አልተደባለቀም። በበረዶ ላይ 5 × ፍርፋሪ ኢንዛይም ድብልቅ reagent ይቀልጡ። ከቀዘቀዙ በኋላ የቱቦውን የታችኛው ክፍል በቀስታ በማንኳኳት reagent ን በእኩል ይቀላቅሉ። የ reagent አዙሪት አታድርጉ!

ለ) የዲ ኤን ኤ ግብዓቱ ናሙና ኤዲታ ወይም ሌሎች ብክለቶችን ይ theል በጨው አየኖች የመንጻት ደረጃ ውስጥ የጨው ion ዎችን እና chelating ወኪሎችን ማሟላቱ በተለይ ለሙከራው ስኬት አስፈላጊ ነው። ዲ ኤን ኤ በ 1 × TE ውስጥ ከተበተነ ፣ መከፋፈልን ለማከናወን በመመሪያው ውስጥ የተሰጠውን ዘዴ ይጠቀሙ። በመፍትሔው ውስጥ ያለው የኢዲታ ክምችት እርግጠኛ ካልሆነ ፣ ዲ ኤን ኤውን ለማጥራት እና ለቀጣይ ምላሽ በተበታተነ ውሃ ውስጥ እንዲሟሟት ይመከራል።

ሐ) ትክክል ያልሆነ የመጀመሪያ ዲ ኤን ኤ መጠነ -መጠን የተቆራረጠ የዲ ኤን ኤ መጠን ከዲ ኤን ኤ ግብዓት መጠን ጋር በቅርበት የተዛመደ ነው። ከመከፋፈሉ ሕክምና በፊት ፣ በኩቢት ፣ ፒኮግራሪን እና ሌሎች ዘዴዎችን በመጠቀም የዲ ኤን ኤ ትክክለኛ መጠን በምላሹ ስርዓት ውስጥ ያለውን የዲ ኤን ኤ መጠን በትክክል መወሰን አስፈላጊ ነው።

 መ) የምላሽ ሥርዓቱ ዝግጅት መመሪያውን አይከተልም የተቆራረጠ የምላሽ ስርዓት መዘጋጀት እንደ መመሪያው በጥብቅ በበረዶ ላይ መከናወን አለበት። ምርጡን ውጤት ለማረጋገጥ ሁሉም የምላሽ ክፍሎች በበረዶ ላይ መቀመጥ አለባቸው እና የምላሽ ስርዓት ዝግጅት ከተጠናቀቀ በኋላ መከናወን አለበት። ዝግጅቱ ከተጠናቀቀ በኋላ እባክዎን በደንብ ለመደባለቅ ይግቡ ወይም ፓይፕ ያድርጉ። አዙሪት አታድርጉ!

1. ተገቢ ያልሆነ የማደባለቅ ዘዴ (ሽክርክሪት ፣ ሁከት ማወዛወዝ ፣ ወዘተ) የቤተ -መጻህፍት ቁርጥራጮችን (በሚከተለው ስእል እንደሚታየው) ያልተለመደ ስርጭት ያስከትላል ፣ በዚህም የቤተ -መጻህፍቱን ጥራት ይነካል። ስለዚህ ፣ የ Fragmentation Mix ምላሹን መፍትሄ ሲያዘጋጁ ፣ እባክዎን ለመደባለቅ በእርጋታ ወደላይ እና ወደ ታች ፒፕት ያድርጉ ፣ ወይም በእኩል ለማንሸራተት እና ለመደባለቅ የጣት ጫፉን ይጠቀሙ። ከአዙሪት ጋር እንዳይቀላቀሉ ይጠንቀቁ።

2. ከፍተኛ ንፅህና ዲ ኤን ኤ ለቤተ መፃህፍት ግንባታ ስራ ላይ መዋል አለበት

■ ጥሩ የዲ ኤን ኤ ታማኝነት - የኤሌክትሮፊሶራይዝ ባንድ ከ 30 ኪባ በላይ ነው ፣ ያለ ጭራ

■ OD260/230:> 1.5

■ OD260/280: 1.7-1.9

3. የዲ ኤን ኤ ግብዓት መጠን ትክክለኛ መሆን አለበት ከናኖድሮፕ ይልቅ ዲ ኤን ኤን ለመለካት Qubit እና PicoGreen ዘዴዎችን ለመጠቀም ይመከራል።

4. በዲ ኤን ኤ መፍትሄ ውስጥ ያለው የኢዴታ ይዘት መወሰን አለበት EDTA በተበታተነ ምላሽ ላይ ትልቅ ተጽዕኖ አለው። የኢዴታ ይዘት ከፍ ያለ ከሆነ ፣ ከሚቀጥለው ምርመራ በፊት የዲ ኤን ኤ መንጻት ያስፈልጋል።

5. የተቆራረጠ የምላሽ መፍትሔ በበረዶ ላይ መዘጋጀት አለበት። የመከፋፈል ሂደት ለምላሽ የሙቀት መጠን እና ጊዜ (በተለይም ማበልጸጊያ ከተጨመረ በኋላ) ስሜታዊ ነው። የምላሽ ጊዜን ትክክለኛነት ለማረጋገጥ እባክዎን በበረዶ ላይ የምላሽ ስርዓት ያዘጋጁ።

6. የመበታተን ምላሽ ጊዜ ትክክለኛ መሆን አለበት የመከፋፈል ደረጃው የምላሽ ጊዜ በቀጥታ የተቆራረጠውን ምርቶች መጠን ይነካል ፣ በዚህም በቤተመጽሐፍት ውስጥ የዲ ኤን ኤ ቁርጥራጮችን የመጠን ስርጭት ይነካል።

1. ለዚህ ኪት ምን ዓይነት ናሙና ተግባራዊ ይሆናል?

የዚህ ኪት የሚመለከተው የናሙና ዓይነት በጥሩ አር ኤን ኤ ታማኝነት ጠቅላላ አር ኤን ኤ ወይም የተጣራ ኤምአርአይ ሊሆን ይችላል። ቤተ -መጽሐፍቱን ለመገንባት ጠቅላላ አር ኤን ኤ ጥቅም ላይ ከዋለ በመጀመሪያ አርኤንአን ለማስወገድ የ አር ኤን ኤን የመሟጠጥ ኪት (ድመት#4992363/4992364/4992391) መጠቀም ይመከራል።

2. በዚህ ኪት ቤተመፃሕፍት ለመገንባት የ FFPE ናሙናዎች ጥቅም ላይ ሊውሉ ይችላሉ?

በኤፍኤፍፒ ናሙናዎች ውስጥ ያለው ኤምአርአይ በአንጻራዊ ሁኔታ ደካማ በሆነ ታማኝነት በተወሰነ ደረጃ ዝቅ ይላል። ይህንን ኪት ለቤተመጽሐፍት ግንባታ በሚጠቀሙበት ጊዜ የመከፋፈል ጊዜን ማመቻቸት (የመከፋፈል ጊዜን ማሳጠር ወይም መከፋፈልን አለመፈጸም) ይመከራል።

3. በምርት መመሪያው ውስጥ የቀረበው የመጠን ምርጫ ደረጃን በመጠቀም ፣ የገባው ክፍል ትንሽ መዛባት እንዲታይ የሚያደርገው ምንድን ነው?

በዚህ ምርት ማኑዋል ውስጥ የመጠን ምርጫ ደረጃን መሠረት በማድረግ የመጠን ምርጫ በጥብቅ ይከናወናል። ማዛባት ካለ ፣ ምክንያቱ መግነጢሳዊ ዶቃዎች ከክፍል ሙቀት ጋር ያልተመጣጠኑ ወይም ሙሉ በሙሉ ያልተደባለቁ ፣ ፓይፕቱ ትክክል ያልሆነ ወይም ፈሳሹ በጫፉ ውስጥ የቀረ ሊሆን ይችላል። ለሙከራው ምክሮቹን በዝቅተኛ ማስተዋወቂያ እንዲጠቀሙ ይመከራል።

4. በቤተመፃህፍት ግንባታ ውስጥ አስማሚዎች ምርጫ

የቤተ መፃህፍት ግንባታ ኪት አስማሚ reagent አልያዘም ፣ እና ይህንን ኪት ከ TIANSeq ነጠላ-ማውጫ አስማሚ (ኢሉሚና) (4992641/4992642/4992378) ጋር አብሮ ለመጠቀም ይመከራል።

5. የቤተ -መጻህፍት QC

የቤተ መፃህፍት መጠነ -ልኬት ማወቂያ - ኩቢት እና qPCR የቤተ -መጻህፍቱን የጅምላ ማጎሪያ እና የሞላ ትኩረትን በቅደም ተከተል ለመወሰን ያገለግላሉ። ክዋኔው በጥብቅ በምርት መመሪያው መሠረት ነው። የቤተ መፃህፍቱ ትኩረት በአጠቃላይ የ NGS ቅደም ተከተል መስፈርቶችን ያሟላል። የቤተ መፃህፍት ስርጭት ክልል መለየት - የቤተመፃህፍት ስርጭትን ክልል ለመለየት Agilent 2100 Bioanalyzer ን በመጠቀም።

6. የማጉላት ዑደት ቁጥር ምርጫ

በመመሪያው መሠረት የ PCR ዑደቶች ብዛት ከ6-12 ነው ፣ እና የ PCR ዑደቶች ብዛት እንደ ናሙና ግብዓት መሠረት መመረጥ አለበት። ከፍተኛ ምርት በሚሰጡ ቤተመፃህፍት ውስጥ ማጉላት ብዙውን ጊዜ በተለያዩ ዲግሪዎች ውስጥ ይከሰታል ፣ ይህም በአግላይንት 2100 ባዮአናላይዘር ማወቂያ ውስጥ ከታለመው ክልል ጫፍ በኋላ በትንሹ ተለቅ ያለ ጫፍ ይታያል ፣ ወይም የተገኘው የኩቢት ክምችት ከ qPCR ያነሰ ነው። ቀለል ያለ ማጉላት የተለመደ ክስተት ነው ፣ ይህም በቤተ -መጽሐፍት ቅደም ተከተል እና በቀጣይ የመረጃ ትንተና ላይ ተጽዕኖ አያሳድርም።

7. ስፒኮች በአግላይንት 2100 ባዮአናሊዘር ማወቂያ መገለጫ ውስጥ ይታያሉ

በ Agilent 2100 Bioanalyzer ማወቂያ ውስጥ የሾሉ ብቅ ማለት በተወሰኑ መጠኖች ውስጥ ብዙ ቁርጥራጮች በሚኖሩባቸው የናሙናዎች ባልተከፋፈለ ምክንያት ነው ፣ እና ይህ ከ PCR ማበልፀግ በኋላ የበለጠ ግልፅ ይሆናል። በዚህ ሁኔታ ፣ የመጠን ምርጫውን ላለማከናወን ፣ ማለትም የተቆራረጠውን ሁኔታ ለ 94 ደቂቃዎች ያህል እንዲቆራረጥ / እንዲቆጠር ይመከራል ፣ ይህም የተቆራረጠ ስርጭቱ አነስተኛ እና የተከማቸ ሲሆን ፣ ተመሳሳይነት ሊሻሻል ይችላል።