FastKing አንድ እርምጃ RT-PCR Kit

ኤ -1 አር ኤን የተዋረደ ነው

—— ከፍተኛ ጥራት ያለው አር ኤን ኤን ያለ ብክለት ያፅዱ። አር ኤን ኤ የወረደበት ንጥረ ነገር የአር ኤን ኤ ውድቀትን ለመከላከል በተቻለ መጠን አዲስ መሆን አለበት። ከ RT ምላሽ በፊት በተከለከለ ጄል ላይ የአር ኤን ኤን ታማኝነትን ይተንትኑ። አር ኤን ኤ ከተመረተ በኋላ በ 100% ፎርማዳይድ ውስጥ መቀመጥ አለበት። የ RNase ማገጃ ጥቅም ላይ ከዋለ የማሞቂያው የሙቀት መጠን <45 ° ሴ መሆን አለበት ፣ እና ፒኤች ከ 8.0 በታች መሆን አለበት ፣ አለበለዚያ ማገጃው ሁሉንም የታሰሩ RNase ን ይልቃል። በተጨማሪም ፣ RNase inhibitor ≥ 0.8 ሚሜ DTT ን በሚይዙ መፍትሄዎች ውስጥ መጨመር አለበት።

A-2 አር ኤን ኤ የተገላቢጦሽ የመግለጫ ምላሾች አጋቾችን ይ containsል

—— የተገላቢጦሽ ግልባጭ አጋጆች ኤስዲኤስ ፣ ኤዲታ ፣ ግሊሰሮል ፣ ሶዲየም ፒሮፎስፌት ፣ ስፐርሚዲን ፣ ፎርማሚድ ፣ ጓአኒዲን ጨው ፣ ወዘተ መቆጣጠሪያ አር ኤንኤውን ከናሙናው ጋር ይቀላቅሉ ፣ እና መከላከያው መኖሩን ለማረጋገጥ ከቁጥጥር አርኤን ምላሽ ጋር ያወዳድሩ። አጋቾችን ለማስወገድ አር ኤን ኤ ዝናብን በ 70% (v/v) ኤታኖል ይታጠቡ።

ሀ -3 የመጀመሪያውን የሲዲኤንኤ ክር ለማቀናጀት የሚያገለግሉ የፕሪሚኖች ማነስ

—— የመቀነስ የሙቀት መጠኑ በሙከራው ውስጥ ለተጠቀሙባቸው ጠቋሚዎች ተስማሚ መሆኑን ይወስኑ። ለአጋጣሚ ሄክሳመሮች የምላሹ የሙቀት መጠን ከመድረሱ በፊት ሙቀቱን በ 25 ዲግሪ ሴንቲ ግሬድ ለ 10 ደቂቃዎች እንዲቆይ ይመከራል። ለጂን-ተኮር ጠቋሚዎች (ጂፒኤስ) ፣ ሌላ GSP ን ይሞክሩ ፣ ወይም ወደ oligo (dT) ወይም በዘፈቀደ ሄክሳመር ይቀይሩ።

ሀ -4 አነስተኛ መጠን የመነሻ አር ኤን ኤ

——የ አር ኤን ኤ መጠን ይጨምሩ። ለ RNA ናሙናዎች ከ 50 ng በታች ፣ 0.1 μg ወደ 0.5 μg acetyl BSA በመጀመሪያው ክር cDNA ውህደት ውስጥ ሊያገለግል ይችላል።

ሀ -5 የዒላማው ቅደም ተከተል በተተነተኑ ሕብረ ሕዋሳት ውስጥ አልተገለጸም።

—— ሌሎች ሕብረ ሕዋሳትን ይሞክሩ።

የ A-6 PCR ምላሽ አልተሳካም

—— ለሁለት-ደረጃ RT-PCR ፣ በ PCR ደረጃ ውስጥ ያለው የሲዲኤን አብነት ከምላሽ መጠን 1/5 መብለጥ አይችልም።

ሀ -1 የፕሪሚየር እና አብነቶች ልዩ ያልሆነ ማጠናከሪያ

—— የ 3'-መጨረሻ ጠቋሚዎች 2-3 ዲጂ ወይም ዲሲ መያዝ የለባቸውም። በዘፈቀደ ጠቋሚዎች ወይም oligo (dT) ምትክ በመጀመሪያው ክር ውህደት ውስጥ ጂን-ተኮር ጠቋሚዎችን ይጠቀሙ። በመጀመሪያዎቹ ዑደቶች ውስጥ ከፍ ያለ የመቀየሪያ ሙቀትን ይጠቀሙ ፣ ከዚያ ዝቅተኛ የማቅለጫ ሙቀትን ይጠቀሙ። የምላሹን ልዩነት ለማሻሻል ለ PCR ትኩስ ጅምር Taq ዲ ኤን ኤ ፖሊሜሬዝ ይጠቀሙ።

ሀ -2 የጂን-ተኮር ጠቋሚዎች ደካማ ንድፍ

—— ለቅድመ -ንድፍ ንድፍ ተመሳሳይ መርሆዎችን ይከተሉ።

ኤ -3 አር ኤን በጄኖሚክ ዲ ኤን ኤ ተበክሏል

—— አር ኤን ኤን ከ PCR- ደረጃ DNase I. ጋር ዲ ኤን ኤ ብክለትን ለመለየት ያለ ግልባጭ ግልባጭ ያለ መቆጣጠሪያ ምላሽ ያዘጋጁ።

A-4 የ primer dimer ምስረታ

—— በ 3 end መጨረሻ ላይ ያለ ተጓዳኝ ቅደም ተከተሎች ያለ ፕሪሚየር ዲዛይን ያድርጉ።

A-5 በጣም ከፍ ያለ ኤም²⁺ ትኩረት

—— ኤምጂን ያመቻቹ²⁺ ለእያንዳንዱ አብነት እና የመጀመሪያ ውህደት ትኩረት

ኤ -6 በውጭ ዲ ኤን ኤ ተበክሏል

—— አየር-ተከላካይ ምክሮችን እና UDG ኢንዛይሞችን ይጠቀሙ።

ሀ -1 የመጀመሪያው የሽቦ ምርት ይዘት በጣም ከፍተኛ ነው

—— በተለመደው የ PCR ምላሽ ደረጃ ውስጥ የመጀመሪያውን የሽቦ ምርት መጠን ይቀንሱ።

A-2 በ PCR ምላሽ ውስጥ በጣም ከፍተኛ መጠን ያለው የመጀመሪያ ደረጃ

—— ቀዳሚ ግብዓት ይቀንሱ።

A-3 በጣም ብዙ ዑደቶች

—— የ PCR ምላሽን ሁኔታዎችን ያመቻቹ እና የ PCR ዑደት ቁጥርን ይቀንሱ።

ሀ -4 በጣም ዝቅተኛ የመቀነስ ሙቀት

—— ልዩ ያልሆነ ጅምር እና ማራዘምን ለመከላከል የአናሎግ ሙቀትን ይጨምሩ።

ሀ -5 በዲኤንኤ ዲ ኤን ኤ ውድቀት የተፈጠረውን የኦሊጉኑክሊዮታይድ ቁርጥራጮች ልዩ ያልሆነ ማጉላት —— የዲ ኤን ኤ ብክለትን ለመከላከል ከፍተኛ ጥራት ያለው አር ኤን ኤ ያውጡ።

RT-PCR አር ኤን ኤን ወደ ሲዲኤኤን መገልበጥ ነው ፣ እና ከዚያ የታለመውን ቁርጥራጭ ለማጉላት በግልባጭ የተቀዳውን ሲዲኤን ለ PCR ምላሽ እንደ አብነት ይጠቀሙበት። በሙከራው የተወሰኑ ሁኔታዎች መሠረት የዘፈቀደ ጠቋሚዎችን ፣ ኦሊጎ ዲቲ እና ጂን የተወሰኑ ጠቋሚዎችን ይምረጡ። ከላይ የተጠቀሱት ሁሉም ጠቋሚዎች ያለ የፀጉር ማያያዣ መዋቅር ለአጭር የዩኩሪዮቲክ ሴል ኤምአርአን ሊያገለግሉ ይችላሉ።

የዘፈቀደ ፕሪመር-ለፀጉር ረጅም መዋቅር (አር ኤን ኤ) ከፀጉር መሰንጠቂያ አወቃቀር ፣ እንዲሁም እንደ አርአርኤን ፣ ኤምአርኤን ፣ tRNA ፣ ወዘተ የመሳሰሉት ሁሉም ዓይነት አር ኤንኤዎች ተስማሚ ናቸው እነሱ በዋነኝነት ለአንድ አብነት ለ RT-PCR ምላሽ ያገለግላሉ።

Oligo dT: ለኤንኤንኤ በ polyA ጅራት (ፕሮካርዮቲክ አር ኤን ኤ ፣ ዩኩሪዮቲክ ኦሊጎ ዲቲ አር አር ኤን ኤ እና አር ኤን ኤ ፖሊአ ጅራት የላቸውም) ተስማሚ። ኦሊጎ ዲቲ ከፖሊአ ጅራት ጋር የተሳሰረ ስለሆነ ፣ የአር ኤን ኤ ናሙናዎች ጥራት ከፍ ያለ መሆን ይጠበቅበታል ፣ እና ትንሽ የመበስበስ እንኳን የሙሉ-ርዝመት ሲዲኤን ውህደትን መጠን በእጅጉ ይቀንሳል።

ጂን-ተኮር ፕሪመር-የታለመው ቅደም ተከተል በሚታወቅበት ሁኔታ ተስማሚ ለሆነ የአብነት ቅደም ተከተል ተጨማሪ።

ሁለት መንገዶች አሉ

1. የውስጥ ማጣቀሻ ዘዴ - በንድፈ ሀሳብ ፣ ሲዲኤንኤ የተለያየ ርዝመት ያላቸው የዲ ኤን ኤ ቁርጥራጮች ነው ፣ ስለዚህ የኤሌክትሮፊሶሪስ ውጤት ስሚር ነው። የአር ኤን ኤ ብዛት ዝቅተኛ ከሆነ በኤሌክትሮፊሮራይዝስ ውስጥ ምንም ምርት አይታይም ፣ ግን ይህ ማለት ምንም ምርት በ PCR አይጨምርም ማለት አይደለም። በአጠቃላይ ሲዲኤንኤን ለመለየት የውስጥ ማጣቀሻ ጥቅም ላይ ሊውል ይችላል። ውስጣዊ ማጣቀሻው ውጤት ካለው ፣ የሲዲኤንኤ ጥራት በመሠረቱ ሊረጋገጥ ይችላል (በጥቂት ጉዳዮች ፣ የታለመው የጂን ቁርጥራጭ በጣም ረጅም ከሆነ ፣ የማይካተቱ ሊኖሩ ይችላሉ)።

2. በዚህ አብነት የተስፋፋ የታወቀ ጂን ካለ ፣ በዚህ ጂን ዋናዎች ሊረጋገጥ ይችላል። የውስጥ ማጣቀሻ ማጉላት የግድ በሲዲኤን ላይ ምንም ችግር የለም ማለት አይደለም። ውስጣዊ ማጣቀሻ በሲዲኤንኤ ውስጥ ከፍተኛ ብዛት ስላለው ለማጉላት ቀላል ነው። ሲዲኤን በተለያዩ ምክንያቶች በከፊል ከተበላሸ ፣ ከአጋጣሚ አንፃር ፣ የ PCR የዝቅተኛ የዒላማ ጂኖች ውጤቶች በእጅጉ ይጎዳሉ። ውስጣዊ ማጣቀሻ አሁንም በብዛት በብዛት ቢሆንም ፣ ማጉላቱ ምናልባት ላይጎዳ ይችላል።

አር ኤን ኤን በከፊል ያዋርዳል። አር ኤን ኤ ን ታማኝነትን ይወቁ እና ያፅዱ

የተለያዩ ዝርያዎች አር ኤን ኤ ይዘቶች የተለያዩ ሊሆኑ ይችላሉ ፣ ግን በአጠቃላይ ፣ የተወሰደው ጠቅላላ አር ኤን ኤ በጄል ኤሌክትሮፊሮሪስ ውስጥ ሁለት ግልፅ 28S እና 18S ባንዶችን መያዝ አለበት ፣ እና የቀድሞው ባንድ ብሩህነት ከኋለኛው ጋር ሁለት እጥፍ ከፍ ያለ መሆን አለበት። የ 5 ኤስ ባንድ አርኤን (ኤን ኤ) መበላሸቱን ያመለክታል ፣ እና ብሩህነቱ ከተበላሸ ደረጃ ጋር ተመጣጣኝ ነው። የውስጣዊ ማጣቀሻ ስኬታማ ማጉላት በአር ኤንአይ ላይ ምንም ችግር የለም ማለት አይደለም ፣ ምክንያቱም የውስጥ ማጣቀሻው በከፍተኛ ሁኔታ የተበላሸ ስለሆነ ፣ መበላሸቱ ከባድ እስካልሆነ ድረስ አር ኤን ኤ ሊጨምር ይችላል። ኦህዴድ₂₆₀/ኦ.ዲ₂₈₀በ spectrophotometer የሚለካው የንፁህ አር ኤን ኤ ሬሾ ከ 1.9 እስከ 2.1 መካከል መሆን አለበት። በአር ኤን ኤ ውስጥ አነስተኛ የፕሮቲን ርኩሰት መጠን ጥምርታውን ይቀንሳል። እሴቱ በጣም ዝቅተኛ እስካልሆነ ድረስ RT አይጎዳውም። ለ RT በጣም አስፈላጊ የሆነው አር ኤን ኤ ታማኝነት ነው።

የውስጥ ማጣቀሻ ጂን ማራዘሙ RT የተሳካ መሆኑን ብቻ ሊያመለክት ይችላል ፣ ግን የግድ ከሲዲኤንኤ ክር ጋር አይዛመድም። ውስጣዊ የማጣቀሻ ቁርጥራጮች በአጠቃላይ መጠናቸው አነስተኛ እና በመግለጫው ከፍ ያሉ በመሆናቸው በግልባጭ ግልባጭ ስኬታማ ለመሆን ቀላል ናቸው። ሆኖም ፣ የዒላማው ጂን መጠን እና መግለጫ ከጂን ወደ ጂን ይለያያል። የሲዲኤንኤ ጥራት በውስጥ ማጣቀሻ ብቻ ሊፈረድ አይችልም ፣ በተለይም ከ 2 ኪባ በላይ ለሆኑ የታለመ ቁርጥራጮች።

አንዳንድ ናሙናዎች የተወሳሰቡ ሁለተኛ መዋቅሮች አሏቸው ፣ ወይም የበለፀገ የጂ.ሲ.ሲ ይዘት አላቸው ፣ ወይም በዝቅተኛ ብዛት ውድ ናቸው። በእነዚህ አጋጣሚዎች ፣ በዒላማው ቁርጥራጭ መጠን እና ናሙናው መሠረት ተገቢው የተገላቢጦሽ ግልባጭ መመረጥ አለበት። ከፍተኛ የጂሲ ይዘት እና የተወሳሰበ ሁለተኛ መዋቅር ላላቸው አር ኤን ኤ አብነቶች ፣ ሁለተኛውን መዋቅር በዝቅተኛ የሙቀት መጠን ወይም በተለመደው በግልባጭ ትራንስክሪፕት ለመክፈት አስቸጋሪ ነው። ለእነዚህ አብነቶች ፣ የተገላቢጦሽ ግልባጩ አፈጻጸሙ ከ M-MLV ተከታታይ ግልባጭ ትራንስክሪፕት በግልጽ የተሻለ ስለሆነ ፣ የተለያዩ የ RNA አብነቶችን በብቃት መገልበጥ እና አር ኤን ኤን ወደ ሲዲኤኤን የመጀመሪያ ክር እስከ ከፍተኛው ድረስ ሊለውጥ ስለሚችል ፣ ለእሱ አብነቶች Quant Reverse Transcriptase ሊመረጥ ይችላል። አጠቃላይ የተገላቢጦሽ ትራንስክሪፕት ኪት ሲጠቀሙ ፣ 20 μl ስርዓት ከጠቅላላው አር ኤን ኤ 1 ጂግ ብቻ ወደ ግልባጭ መቅዳት ይችላል። እባክዎን ለኪቲው ከፍተኛው የ RT አቅም ትኩረት ይስጡ። አብነቱ ከመጠን በላይ ከተጨመረ ፣ የተገላቢጦሽ ግልባጭ አር ኤን ኤ በከፍተኛ ብዛት ይደግፋል። ስለዚህ የስርዓቱን ከፍተኛ አቅም ባያልፍ ይሻላል።

ኤ -1 አር ኤን ኤ በከፍተኛ ሁኔታ ከተበላሸ እና RT ከተሳካ ይወስኑ

በአጠቃላይ ፣ የውስጥ ማጣቀሻ ማጉያ ውድቀት ምክንያቱ ብዙውን ጊዜ በከባድ አር ኤን ኤ ውድቀት ምክንያት ነው። ሌላ ሊሆን የሚችል ምክንያት የተገላቢጦሽ ጽሑፍ አለመሳካት ነው። የሲዲኤንአን ነጠላ ክር ጥራት ለመገምገም የውስጥ ማጣቀሻ እንደ መስፈርት ሆኖ ሊያገለግል አይችልም ፣ ነገር ግን የአርኤንኤ ጥራት ምንም ችግር ከሌለ የተገላቢጦሽ ጽሑፍ ስኬታማ መሆን አለመሆኑን ለመገምገም እንደ መስፈርት ሆኖ ሊያገለግል ይችላል። በተገላቢጦሽ የመግቢያ ሂደት ውስጥ በጣም አስፈላጊው ነገር የምላሽ ቅልጥፍናን ለማሻሻል የማያቋርጥ የሙቀት መጠንን እና የማያቋርጥ የምላሽ ስርዓትን መጠበቅ ነው።

ሀ -2 የውስጥ ማጣቀሻ ጂኖችን ለማጉላት ቀዳሚዎቹ አስተማማኝ ስለመሆናቸው እና በ PCR ውስጥ ጥቅም ላይ የዋሉ reagents ላይ ችግሮች ካሉ ይወስኑ።

ለተነፃፃሪ መጠነ -ልኬት ፣ አርኤንአይ ከተገላቢጦሽ ግልባጭ በፊት መጠራት አለበት ፣ ይህም በብዙ የተገላቢጦሽ ግልባጭ ኪትዎች ውስጥም ያስፈልጋል ፣ ለምሳሌ ፣ የአር ኤን ኤ ግብዓቱን እንደ 1 μ ግ ይለኩ። የተገላቢጦሽ ሲዲኤንኤ (RNA) ፣ ኦሊጎ ዲቲ ፣ ኢንዛይም ፣ ዲኤን ቲፒ እና ሌላው ቀርቶ ትንሽ የዲ ኤን ኤ ቅሪትን ጨምሮ የተቀላቀለ መፍትሄ ስለሆነ ፣ መዛባት ይከሰታል ፣ ስለሆነም የሲዲኤንኤን በትክክል ለመገመት አይቻልም። ስለዚህ ፣ አር ኤን ኤ መጠኑን ማረጋገጥ አስፈላጊ ነው። በተለያዩ ናሙናዎች ውስጥ የተገላቢጦሽ ግልባጭ ቅልጥፍናን ከግምት ውስጥ በማስገባት የተገኘው የሲዲኤንኤ መጠን አንድ መሆን አለበት ፣ እና የቁጥር ትንተና በጠቅላላው አር ኤን ኤ ተመሳሳይ መጠን ውስጥ የተለያዩ ጂኖችን የመግለፅ ደረጃዎችን ንፅፅር ሊያሳይ ይችላል። አንጻራዊ የፍሎረሰንስ መጠነ -መጠን PCR ን ሲያከናውን ፣ የውስጣዊ ማጣቀሻው ጂን እንደ ማጣቀሻ ሆኖ ሊሠራ ስለሚችል ከተገላቢጦሽ ጽሑፍ በኋላ መጠነ -ሰፊ ሲዲኤን ላይፈለግ ይችላል።

እሱ በዋነኝነት ከጂኖች ጋር ይዛመዳል ፣ እና ረዥም ቁርጥራጭ ግልባጭ ግልባጭ ለአብዛኞቹ ጂኖች የሚቻል አይደለም። በመጀመሪያ ፣ የተገላቢጦሽ ግልባጩ ውጤታማነት ከ PCR በጣም ያነሰ ነው። በሁለተኛ ደረጃ ፣ የ GC የበለፀገ ክልል እና የብዙ ጂኖች ሁለተኛ አወቃቀር ሁለቱንም የተገላቢጦሽ ጽሑፍ እና ፒሲአርን ይገድባል። በመጨረሻም ፣ የ PCR ታማኝነት እና የማጉላት ብቃት በተመሳሳይ ጊዜ ዋስትና ለመስጠት አስቸጋሪ ነው። በተገላቢጦሽ ግልባጭ ሂደት ውስጥ ፣ ለዝቅተኛ ቅጂ ጂኖች ፣ በተለይም oligo dT ን በመጠቀም ረጅም ቁርጥራጭ ለማግኘት ማንም ዋስትና አይሰጥም። ለ 5 'UTR በበለጠ ጂ.ሲ. ፣ የበለጠ ከባድ ነው። ስለዚህ ፣ አሁንም ትራንስክሪፕትን በዘፈቀደ ጠቋሚዎች መቀልበስ ፣ በዒላማው ቁራጭ ውስጥ የተፈጥሮ መሰንጠቂያ ጣቢያዎችን ማግኘት ፣ በክፍሎች ማጉላት እና ከዚያ ገደቡን መፍጨት እና ማጠጋጋት ማከናወን ምክንያታዊ ዘዴ ነው። በአጠቃላይ ፣ ከ 2 ኪባ የሚበልጡ ቁርጥራጮችን በቀጥታ ማጉላት ከባድ ነው ፣ ግን ሁል ጊዜ ማግኘት አይቻልም - 1. በመጀመሪያ ፣ የአር ኤን/ኤም አር ኤን ታማኝነትን ያረጋግጡ ፣ እና TRIZOL ማውጣት ተመራጭ ነው። 2.M-MLV RT-PCR ኪት በቀጥታ ጥቅም ላይ ሊውል ይችላል። የማጉያ ጊዜን ያራዝሙ እና በማጉያ ሂደቱ ውስጥ የዑደት ቁጥርን በትክክል ይጨምሩ። እንደአማራጭ ፣ ጎጆ ያለው PCR ሊተገበር ይችላል ፣ ወይም ከተለመደ የ PCR ማጉላት በፊት በመጀመሪያ በተራዘመ የዲታቴሽን እና የኤክስቴንሽን ጊዜ በመጀመሪያ አንድ ወይም ሁለት ምላሾችን ማከናወን ይችላል ፣ ይህም ቁርጥራጮችን ለማራዘም ሊረዳ ይችላል። ለ polymerase ታማኝነት ትኩረት ይስጡ። 3. Long Taq ተስማሚ ውጤቶችን ለማግኘት በ PCR ውስጥ ሊያገለግል ይችላል። 4. ለፕሮቲን አገላለጽ ትግበራ ፣ ከፍተኛ ታማኝነት ፖሊሜሬዝ መተግበር አለበት።

በ TIANGEN የቀረቡ ሁለት ዓይነት የተገላቢጦሽ ትራንስክሪፕቶች አሉ-Quant/King RTase እና TIANScript M-MLV። በመካከላቸው ያለው ዋነኛው ልዩነት የአብነቶች የግብዓት መጠን ነው። ኳንተን ከሞሎኒ ሙሪን ሉኪሚያ ቫይረስ ከሚገኘው በተለምዶ ከሚጠቀሙት ኤም-ኤም ኤል ቪ የተለየ የተለየ ግልባጭ ግልባጭ ነው። ኳንት በኤንጂኔሪንግ ኤሺቺቺ ኮላይ አዲስ በከፍተኛ ብቃት የተገላቢጦሽ ግልባጭ ትራንስክሪፕት እንደገና ይገለጻል። ኳንት በከፍተኛ የኋላ ግልባጭ እንቅስቃሴ እና በከፍተኛ ምርት 50 ኤን -2 μg አር ኤን ኤን ለማጉላት ተስማሚ ነው። ከተለመደው MMLV ወይም AMV ጋር ሲነጻጸር ፣ የኳንተን ትልቁ ባህርይ ከአር ኤን ኤ አብነቶች ጋር በጣም ጠንካራ ግንኙነት ያለው እና ያለ ከፍተኛ የሙቀት መጠን ማባዛት ውስብስብ አብነቶችን ወደ ግልባጭ የመገልበጥ ችሎታ ነው። ከፍ ያለ የ GC ይዘት ላላቸው አብነቶች ፣ የተገላቢጦሽ ውጤታማነት ከፍ ያለ ነው። ሆኖም ፣ ይህ የተገላቢጦሽ ግልባጭ የ RNase H እንቅስቃሴ አለው ፣ ይህም በሲዲኤንኤ ምርት ርዝመት ላይ ተጽዕኖ ሊያሳድር ይችላል (ለ <4.5 ኪባ አብነቶች ተስማሚ)። ለተለመደ ግልባጭ ግልባጭ ፣ TIANScript MMLV የተገላቢጦሽ ትራንስክሪፕት ይመከራል። ይህ RTase ለረጅም (> 5 ኪባ) ሲዲኤን ውህደት ተስማሚ የሆነ በጣም ደካማ የ RNase H እንቅስቃሴ ያለው የተቀየረ ኢንዛይም ነው።

በሲዲኤን ውህደት እና በማጉላት መካከል ያለውን የቧንቧ ሽፋን ሳይከፍት አንድ-ደረጃ የተገላቢጦሽ ግልባጭ እና የ PCR ማጉያ በተመሳሳይ ቱቦ ውስጥ ይጠናቀቃል ፣ ይህም ብክለትን ለመቀነስ ይረዳል። የተገኙት ሁሉም የሲዲኤንኤ ናሙናዎች ለማጉላት ጥቅም ላይ ስለሚውሉ ፣ ትብነቱ ከፍ ያለ ነው ፣ ቢያንስ ከጠቅላላው አርኤንኤ 0.01 ፒ.ግ. ለስኬት አንድ-ደረጃ RTPCR ፣ ጂን-ተኮር ጠቋሚዎች በአጠቃላይ ሲዲኤን ውህደትን ለመጀመር ያገለግላሉ። ባለሁለት ደረጃ ዘዴ ፣ ማለትም የተገላቢጦሽ ግልባጭ እና የ PCR ማጉላት በሁለት ደረጃዎች ይካሄዳል። በመጀመሪያ የተገላቢጦሽ ግልባጭ cDNA ን ለማግኘት ከአር ኤን ኤ አብነት ይከናወናል ፣ እና የተገኘው ሲዲኤንኤ ለአንድ ወይም ከዚያ በላይ ለተለያዩ የ PCR ምላሾች ተገዥ ነው። ባለሁለት ደረጃ ዘዴው የመጀመሪያውን የሲዲኤን ሕብረቁምፊ ውህደት ለመምራት oligo (dT) ወይም የዘፈቀደ ጠቋሚዎችን መጠቀም ይችላል ፣ እና ሁሉንም የኤምአርኤን መረጃ ከተለየ ናሙና ወደ ግልባጭ ሊቀይር ይችላል።